Die Ionenleitfähigkeits-Rastermikroskopie
Das SICM wurde von Hasma und Mitarbeitern entwickelt, um die Oberflächen von
Isolatoren in leitfähiger Umgebung abzubilden. Die Methode bedient sich eines
Feedback-Verfahrens, bei dem eine vorgegebene Leitfähigkeit zwischen der Spitze einer
elektrolytgefüllten Glaskapillare und einer Referenzelektrode im Bad konstantgehalten
wird. Über die durch Konstanthaltung der Leitfähigkeit erzielte Abstandskontrolle kann
die Oberfläche der nicht-leitfähigen Membran abgetastet werden. Die Abbildung lebender
Epithel- und Muskelzellen mit diesem Verfahren gelang erstmals Korchev und Mitarbeitern (2).
=>Das SICM kann auch mit der "Patch-clamp"- Technik kombiniert werden, um die Lage einzelner
K+-Kanäle auf Muskelmembranen zu lokalisieren (3). Darüber hinaus können Volumenänderungen von
Zellen beobachtet werden (4).
Ein besonderer Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Zellen berührungsfrei
abgetastet werden
können, so dass Langzeituntersuchungen von Membranen lebender Zellen mit
sub-lichtmikroskopischer Auflösung möglich werden.
Wir haben ein neuartiges Ionenleitfähigkeits-Rastermikroskop entwickelt, welches sich von
der ursprünglich von Hansma und Mitarbeitern publizierten Methode in einigen Aspekten
unterscheidet: Um die Stabilität der Messung zu verbessern, verwenden wir anstelle eines
konstanten Stromes zur Steuerung der Annäherung der Elektrode an die Zellmembran kurze
Strompulse. Durch Verwendung der Pulse und Bestimmung des Zugangswiderstandes mittels
der über der Messkapillare abgegriffenen Potentialdifferenz werden
Gleichspannungspotentialschwankungen, die sich bei Messdauern im Stundenbereich kaum
vermeiden lassen, eliminiert. Ein weiterer Unterschied unseres Verfahren besteht darin,
dass die Elektrode nicht in konstantem Abstand (ca. 100nm - constant distance Modus)
über die Membran geführt wird, sondern nach Bestimmung jeder Position zunächst um eine
vorwählbare Distanz von wenigen Mikrometern zurückgefahren wird (backstep-modus).
Das "constant distance" Verfahren ermöglicht zwar einen schnelleren Rastervorgang,
hat aber den Nachteil, dass dann, wenn die Elektrode sich vom Schalenboden aus einem
überhängenden Membranabschnitt nähert, die Elektrode in die Membran hineinfahren kann.
Mit dieser Methode gelingt es uns nun, komplette Nerven- und Gliazellen in
Kulturschalen mit einer Schrittweite von vertikal 0,1 µm und horizontal 0,5 µm
innerhalb von ca. einer halben Stunde abzutasten (5). Das Verfahren ist jetzt einsetzbar,
um Zellbewegungen und Volumenänderungen im Bereich von 20 Minuten bis einigen Stunden
zu beobachten (6,7). In der aktuellen Ausbaustufe ist es möglich, die zu scannenden
Zellen unter Phasenkontrastoptik auszuwählen und Zelloberflächen- und Volumina zu
quantifizieren, wobei z.B. zwischen Somaoberfäche und Oberfläche der Zellfortsätze
unterschieden werden kann. Auf diese Art kann der Einfluss von Wachstumsfaktoren auf
Soma- oder Ausläuferoberfläche unterschieden werden (8).
Unser SICM wurde im Rahmen eines Kooperationsprojektes mit W. Schuhmann, welches
von der DFG im Normalverfahren gefördert wird (Schuh 929/5-1), und mit Hilfe von
Landesgraduiertenstipendien des Landes NRW an Gerd Hoffmann und Stefan Mann zur
Anwendungsreife entwickelt.
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